DB12T 505-2014 玉米转基因成分筛查方法
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ID： |
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0.36 |
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9 |
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日期： |
2016-8-16 |
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B 04,ICS 65.020.01,天津市地方标准,DB12,DB12/T 505—2014,玉米转基因成分筛查方法,Screening method for genetically modified maize,2014-04-22 发布 2014-07-20 实施,天津市质量技术监督局发布,DB12/T 505—2014,I,前 言,本标准按照GB/T 1.1—2009 给出的规则起草,本标准由天津市质量技术监督局提出,本标准起草单位：天津市东丽区产品质量监督检验所、天津市农业质量标准与检测技术研究所,本标准主要起草人：黄凤军、李建、赵新、陈杰、易萌、朱珠、马强、杨炳存,本标准2014 年04 月首次发布,DB12/T 505—2014,1,玉米转基因成分筛查方法,1 范围,本标准规定了玉米中转基因成分定性PCR 筛查的术语和定义、检测方法、结果分析与表述,本标准适用玉米及其制品中zSSIIb 内标准基因、CaMV35S 启动子、NOS 终止子、Bt 基因、bar,基因、HPT 基因的定性PCR 筛查检测,2 规范性引用文件,下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文,件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件,GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法,NY/T 672 转基因植物及其产品检测 通用要求,农业部2031 号公告—19—2013 转基因植物及其产品检测 抽样,农业部1485 号公告—4—2010 转基因植物及其产品成分检测 DNA 提取和纯化,3 术语和定义,下列术语和定义适用于本文件,3.1,zSSIIb 基因 zSSIIb gene,编码玉米淀粉合酶异构体zSTSⅡ-2 的基因,3.2,CaMV 35S 启动子 35S promoter from cauliflower mosaic virus （CaMV）,来自花椰菜花叶病毒的35S 启动子,3.3,NOS 终止子 terminator of nopaline synthase （NOS） gene,来自胭脂碱合成酶基因NOS 的终止子,3.4,Bt 基因 Bt（Bacillus thuringiensis）gene,来源与苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt），可表达一种杀虫晶体蛋白的基因，常,见的Bt基因有cry1Ac基因、cry1Ab基因、cry1Ab/cry1Ac融合基因,3.5,bar 基因 bialaphos resistance gene,来源于土壤吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus），编码膦丝菌素乙酰转移酶（phosphinthricin,acetyltransferase，PAT）。该酶具有对除草剂草丁膦（glufosinate）的耐受性,3.6,HPT 基因 HPT gene,来源于大肠杆菌或链球菌（Streptomyceshy groscopicus），编码潮霉素磷酸转移酶（hygromycin,phosphotransferase）的基因,DB12/T 505—2014,2,4 检测方法,4.1 试剂和材料,4.1.1 实验用水为重蒸馏水或符合GB/T 6682 规定的一级水,4.1.2 琼脂糖,4.1.3 10 g/L 溴化乙锭溶液：称取1.0 g 溴化乙锭（EB），溶于100 mL 水中，避光保存,注：溴化乙锭有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液,4.1.4 10 mol/L 氢氧化钠溶液：在160 mL 水中加入80.0 g 氢氧化钠（NaOH），溶解后再加水定容,到200 mL,4.1.5 500 mmol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液（pH 8.0）：称取18.6 g 乙二铵四乙酸二钠（EDTA-Na2）,加入70 mL 水中，再加入适量氢氧化钠溶液（4.1.4），加热至完全溶解后，冷却至室温，用氢氧化钠,溶液（4.1.4）调pH 至8.0，加水定容至100 mL。在103.4 kPa（121 ℃）条件下灭菌20 min,4.1.6 1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（pH 8.0）：称取121.1 g 三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶,解于800 mL 水中，用盐酸调pH 至8.0，加水定容至1 000 mL。在103.4 kPa（121 ℃）条件下灭菌20,min,4.1.7 TE 缓冲液（pH 8.0）：分别量取10 mL 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（4.1.6）和2 mL 乙二,铵四乙酸二钠溶液（4.1.5），加水定容至1 000 mL。在103.4 kPa（121 ℃）条件下灭菌20 min,4.1.8 50×TAE 缓冲液：称取242.2 g 三羟甲基氨基甲烷（Tris），先用300 mL 水加热搅拌溶解后,加100 mL 乙二铵四乙酸二钠溶液（4.1.5），用冰乙酸调pH 至8.0，然后加水定容到1 000 mL。使用,时用水稀释成1×TAE,4.1.9 加样缓冲液：称取250.0 mg 溴酚蓝，加10 mL 水，在室温下溶解12 h；称取250.0 mg 二甲基,苯腈蓝，用10 mL 水溶解；称取50.0 g 蔗糖，用30 mL 水溶解。混合以上三种溶液，加水定容至100,mL，在4 ℃下保存,4.1.10 DNA 分子量标准：可以清楚的区分50 bp～1 000 bp 的DNA 片段,4.1.11 dNTPs 混合溶液：将浓度为10 mmol/L 的dATP、dTTP、dGTP、dCT……
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